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      云南專業(yè)團隊談PCR擴增實驗室建設方案與規(guī)劃設計

      網(wǎng)站編輯 2021-11-23 06:43:21 閱讀


      PCR實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶(Enzyme)鏈式反應(PolymeraseChainReaction)的簡稱。是一種分子生物學技術,用于放大特定的DNA片段,可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng),能迅速掌握患者體內的病毒含量,其精確度高達納米級別,精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數(shù)量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)。
      開展PCR實驗室應具備的條件
      1、必須擁有標準的的PCR熒光實驗(experiment)室;
      由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前已得到了廣泛應用。
      2、檢測設備必須符合標準PCR熒光實驗(experiment)室設置要求;
      熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析(Analyse)軟件,構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。
      3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認證;
      4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務培訓并取得合格證書;
      PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班,并持證上崗。PCR實驗室通過驗收,實驗室至少必須應有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序(procedure)(SOP)、建立系列質量管理文件等,確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求,確保檢測結果準確、確保實驗室衛(wèi)生安全,確保實驗室長期穩(wěn)定(解釋:穩(wěn)固安定;沒有變動)運行
      5、必須在無菌(意思:沒有活菌)無塵環(huán)境下進行操作
      下面介紹如何建立PCR實驗室
      1、建立樣品準備區(qū)
      這個區(qū)域專門用作樣品的準備,在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施(指針對問題的解決辦法):
      PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。
      組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理,以根據(jù)應用的需要提取DNA或RNA。
      用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。
      DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作,以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。
      大體積樣品應該用單獨包裝的無菌(意思:沒有活菌)一次性移液管吸取。
      管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生,而且管子不能用力崩開,這樣會產(chǎn)生氣溶膠。
      任何時候都應該穿實驗(experiment)服和帶手套,手套要經(jīng)常更換,尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間,經(jīng)常清洗。
      2、樣品準備和RNA-PCRRNA-PCR的額外(extra)步驟(procedure)需要額外的樣品操作,這樣增加了樣品之間污染的機會。化學實驗室提供化學實驗條件及其進行科學探究的重要場所。其內有大量的儀器:鐵架臺、石棉網(wǎng)、酒精燈等實驗工具。通常會配有化學藥品柜,藥柜里面有常用的化學藥品,比如:五水硫酸銅(CuSO4·5H2O,即膽礬),氫氧化鈉溶液,石灰石,鹽酸等。為了避免這一問題,反轉錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。
      3、建立前PCR區(qū)。生物實驗P2室主要用于初級衛(wèi)生服務、診斷和研究,其實驗對象的危害等級為Ⅱ級(中等個體危害,有限群體危害),具體定義為“能引起人類 或動物發(fā)病,但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴重危害的病源體。實驗室感染不導致嚴重疾病,具備有效治療和 預防措施,并且傳播風險有限”。
      該去專門用于準備各種反應,這個區(qū)域必須保持干凈,而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。化學實驗室提供化學實驗條件及其進行科學探究的重要場所。其內有大量的儀器:鐵架臺、石棉網(wǎng)、酒精燈等實驗工具。通常會配有化學藥品柜,藥柜里面有常用的化學藥品,比如:五水硫酸銅(CuSO4·5H2O,即膽礬),氫氧化鈉溶液,石灰石,鹽酸等。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備,特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞(piston)式移液管。
      4、PCR實驗室試劑的操作。
      所用的所有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
      所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新鮮蒸餾(still)的去離子水,用0.22μm過濾的,并且是高壓滅菌(fungus)。
      在20到25貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑,在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。
      所用試劑都應該以大體積配制,實驗一下看試劑是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。
      所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
      新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。
      樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。
      5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。
      可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20或4,在實驗(experiment)室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。
      如果你的實驗室使用多套引物,以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經(jīng)濟,可以考慮(consider)分裝保存夠一天的PCR成分。
      作為一個規(guī)則,應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且,你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證(Experimental)你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。
      陰性樣品要與每組樣品同時做,以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染,陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。
      當做陽性對照時,有兩個理由決定了應該使用最少數(shù)量的核酸。
      由于必須有對照反應,對照模板的特點應該予以考慮。
      6、控制(control)污染的方法。
      已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG,這一技術能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線(Ultraviolet rays),這種方法不能完全消除污染問題,但可以將污染降低幾個數(shù)量級。
      7、后PCR區(qū)PCR完成以后,需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù),應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的,決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。

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